Biotin(비오틴)(제2법) HPLC-UV/PDA/FL

건강기능식품의 기준 및 규격 제4. 3-13-2 비오틴(제2법)

컬럼: [LC/UV, 표1] 전처리칼럼 Capcellpak MF C, SG80(안지름 4.6 mm, 길이 150 mm, 충전입자크기 5 μm), 농축칼럼 Capcellpak C UG120V(안지름 2.0 mm, 길이 35 mm, 충전입자크기 5 μm), 분석칼럼 Capcellpak C UG120V(안지름 1.5 mm, 길이 250 mm, 충전입자크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것 (육방전환밸브 컬럼스위칭 시스템). [LC-MS 대안, 표2] ACQUITY UPLC® BEH(안지름 2.1 mm, 길이 100 mm, 충전입자크기 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것
이동상: [LC/UV, 표1] 전처리칼럼 : 0.01 M 인산이수소칼륨용액 / 분석칼럼 : 0.01 M 인산이수소칼륨용액 : 메탄올 = 90 : 10 (v/v). [LC-MS 대안, 표2] A : 0.1%(v/v) 포름산, B : 0.1%(v/v) 포름산 함유 아세토니트릴, 그라디언트(시간 분 / A% / B%) : 0/100/0 → 5.0/80/20 → 5.2/0/100 → 6.2/0/100 → 7.0/100/0 → 11.0/100/0
유속: [LC/UV] 전처리칼럼 500 μL/분, 분석칼럼 100 μL/분 / [LC-MS 대안] 0.2 mL/분
검출: 자외부흡광광도검출기(UV) 200 nm. LC-MS(질량분석기)를 이용한 정량도 동등하게 허용
주입량: [LC/UV] 100 μL / [LC-MS 대안] 2 μL
컬럼온도: 40℃ (LC/UV·LC-MS 동일)
이온화: ESI, positive (LC-MS 대안 조건, 표2)

표준물질: 비오틴(Biotin, 분자량 244.31, CAS No. 58-85-5). 0.01 M 인산이수소칼륨용액(pH 4.8, 인산이수소칼륨 1.35 g/L)에 녹여 100 mg/L 표준원액(4℃ 이하 암소 보관), 같은 용액으로 희석하여 표준용액(사용 시 제조). LC-MS 대안 조건 상세(표2): 이온화 ESI positive, Monitoring ion 245(precursor ion) / 227, 166(fragment ion), Capillary Voltage 3.5 kV, Source Temp. 120℃, Desolvation Temp. 350℃. 전처리 ① 정제 불필요 시: 균질화 시료 약 0.5~5 g을 50 mL 갈색 부피플라스크에 취해 0.01 M 인산이수소칼륨 용액 40 mL와 클로로포름 5 mL를 넣고 10분 초음파 추출 → 클로로포름 제거 → 정용 → shaker 10분 격렬 진탕 → 0℃에서 4,500 ×g 30분 원심분리 → 상층액을 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과. 전처리 ② 정제 필요 시: 0.15 M 인산나트륨 완충액(pH 7.0) 25 mL로 5분 초음파 추출 → 100℃ 수욕 30분 → 정용·균질화 → 0℃ 4,500 ×g 20분 원심분리 → 여과(Whatman No.2) → 비오틴용 면역친화성 칼럼에 추출액 10 mL 부하 → PBS 10 mL 세척 → 공기 10 mL 배출 → 메탄올 4 mL 용출 → 70℃ 질소 건고 → 0.01 M 인산이수소칼륨 용액 1 mL 재용해. 계산: 비오틴(mg/100 g) = C × (a × b)/S × 100/1,000. 정량한계는 원문 미명시. 참고: 제1법(3-13-1)은 미생물학적 정량법(탁도법)으로 LC법이 아니다.

출처: 건강기능식품공전 · 식약처고시 제2026-43호 (시행 2026.6.11. 시행) · 원문 보기

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